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生物实验的基本技术

发表日期： 2007-8-25 14:10:33 来源：作者：查看次数：

第一节细胞学实验技术

【知识概要】

一、玻片标本的制作技术

制作玻片标本对认识生物体的形态结构具有重要意义。玻片标本有临时玻片标本（如涂片、压片、临时装片）和永久玻片标本（如永久装片、切片）。

1．涂片法

涂片法是将材料均匀地涂布在载玻片上的一种制片方法。

涂片材料有单细胞生物、小型藻类、血液、细菌培养液、动植物的疏松组织、精巢、花药等。

涂片时应注意：（1）载玻片必须清洁。（2）载玻片要持平。（3）涂层须均匀。涂抹液滴在载玻片中间偏右，用解剖刀刃或牙签等涂匀。（4）涂层要薄。用另一载玻片作推片，沿滴有涂抹液的载玻片面（二载玻片夹角应为30°～45°）由右向左轻轻推动，涂成均匀一薄层。（5）固定。如需固定可用化学固定剂或干燥法（细菌）固定。（6）染色。细菌用亚甲基蓝，血液用瑞氏染液。染色液要盖住全部涂面。（7）冲洗。用吸水纸吸干或烤干。（8）封片。长期保存用加拿大的树胶片片。

2．压片法

压片法是将生物材料置于载玻片和盖片之间，施加一定压力，将组织细胞压散的一种制片方法。

压片法的一般过程：（1）取材。观察细胞分裂，应选取细胞分裂旺盛、新鲜的组织细胞为材料。如根尖、茎尖分生组织、骨髓细胞、花药（花粉母细胞）。精巢（精母细胞）等。（2）固定。材料固定可根据需要而定，取材后立即压片观察，可不作单独固定处理（与染色同步进行）；取材后不立即视察，可将材料用固定液（一般用醋酸酒精固定液）固定。固定2～24小时（因材料而异）后用95％乙醇清洗，保存于70％乙醇中，备用。（3）离析。对细胞不易散开材料用水解分离液（如1N HCl或盐酸一酒精液）处理，一般处理6～20min，解离后经水漂洗后方能染色。（4）染色。染色剂种类很多。观察染色体常用醋酸洋红染色液染色。（5）压片。将材料放在载玻片上，加一滴清水或染液，盖上盖玻片用拇指轻轻压片。（6）观察。压片后，即可在显微镜下观察。

3．装片法

装片法是将生物材料采取整体封固制成玻片标本的方法，用此法可制成临时或永久装片。

装片材料有：微小生物如衣藻、水绵、变形虫、水螅，植物的叶表皮；昆虫的翅、足、口器，人的口腔上皮细胞等。

装片法制作时应注意：（1）手持载玻片时，应注意持平，或放在平台上。滴水时水量要适当，以恰好被盖玻片盖满为度。（2）应将材料用解剖针或镊子展开不使重叠，展平在同一平面上。（3）放盖玻片时，从一侧慢慢盖在水滴上，防止出现气泡。（4）染色时，将一滴染色液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从另一侧吸引，使盖玻片下的标本均匀着色。着色后，用同样的方法，滴一滴清水，把染色液吸出后，在显微镜下观察。

二、显微镜基本实验技术

1．低倍镜（4X、10X）的使用方法

显微镜操作主要包括两个方面：（1）光度调节。正确对光是能否成功地观察到物象的首要条件。对光时，先把聚光器上提，打开可变阑，转动反光镜，这时一边看镜内视野，一边调节聚光器螺旋，直至视野内得到均匀而明亮的光线。（2）焦距的调节。调焦时，先把观察的切片，用推进器对正通光孔中央。然后分两步调焦。先用粗调器定焦，用左眼看目镜，使粗调器慢慢上升，直到能清楚地看到标本为止。随后调节细调器，使镜筒微微升降，至物象更清晰为止。

2．高倍镜（40X）的使用方法

（1）将在低倍镜中找到的物象欲放大部分移到视野中央。（2）转动物镜转换器，使40X物镜对准通光孔，转动时从侧面注视物镜，以防镜头紧压玻片。（3）调节细调螺旋，使物象清晰。

3．油镜（100X）的使用方法

（l）先用低倍镜找到欲观察细微结构，将其结构移至视野中央换高倍镜。（2）下降镜台，在玻片标本上滴一滴香柏油，转换油镜。从侧面注视油镜，把镜台上升，使油镜头浸在香柏油滴中。（3）转动细调螺旋，使物象清晰，进行观察。（4）观察完毕，用镜头纸擦去油镜头和玻片上的香柏油，再用少许二甲苯或乙醚 / 无水乙醇把镜头擦干净。

4．安装指针的简易方法

将目镜的上盖（一片透镜）旋下，剪取一小段头发（其长度约等于目镜的半径），用镊子夹住一端，将另一端蘸少许中性胶，将其粘在目镜内壁的金属光栏（一铁圈）上。稍干后，旋紧上盖，即可使用。

三、单细胞的计数方法

在细菌培养和体外细胞培养，以及环境监测血液检查中常常需要统计细菌、细胞、单细胞藻类、原生动物、血细胞、花粉等数量。细胞计数方法的原理是把一定体积的细胞液体，在显微镜下直接计算其个数，利用所得结果推算出每毫升水体中的单细胞数。具体方法如下：

1．水滴计数法

用管口圆而平滑、大小适宜的吸管，吸取1mL水，然后测定这一吸管1rnL水可滴出多少滴水（反复测定，直到准确为止）。这样可以计算出该吸管滴出的每一滴水的体积。用吸管取样时，如果单细胞是活动的要用碘杀死后，再计数；如果样品浓度太大，计数困难，按倍数稀释到适宜的浓度；另外，取样前必须搅拌，搅拌后，立即取样。取样后，在显微镜下计数，得到一滴水中细胞数的平均值后，可依下列公式求出1mL水体中所含细胞的数目。

1mL水体中含细胞数＝计数平均值×定量吸管每毫升的滴数×稀释倍数

2．血球计数板计数法

血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中央有两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见下图），每格面积1mm²，加盖玻片后的深度为0.1mm。因此，每大方格容积为0.1mm。另外，中央大方格以双线等分为25个中方格。每个中方格又分16个小方格，供细胞计数用。

1 2

3 4

血球计数板的构造

l．顶面观 2．侧面观 3．放大后的网格 4．放大后的计数室

计数方法：首先用吸管吸取少许稀释倍数的单细胞悬液，从盖片端滴一小滴（不宜过多），液体自行向内渗入，静置数分钟后，再放在微镜下观察计数。一般选取计数室内四个角及中央五个中方格（80小方格）计数，若细胞位于小方格的线上，应遵循“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差。计数应重复3次，取其平均值。数完毕后，依下式计算：

每1mL悬液细胞数或每克细胞数＝80个小方格细胞总数 / 80×400×10000×稀释倍数

四、显微测微尺的应用方法

显微测微尺是在显微镜下测量生物细微结构的测微工具，用它测量细胞各部分的厚薄和大小。

显微测微尺（见下图）包括目镜测微尺（目尺）和物镜测微尺（台尺），测量时须将其配合使用方可达到测量目的。目镜测微尺为一圆形玻片，玻片中央有一横线刻有大小格的等距离线。物镜测微尺有一特制的玻片，中央圆圈内有一1mm长分为100个等距小格的刻线，每一小格即10μm。

目镜测微尺物镜测微尺

显微测微尺

测量方法：首先须算出目镜测微尺的每一格在不同倍物镜下各为多少μm。即取下接目镜卸下透镜，装上目镜测微尺。然后将物镜测微尺放在镜台中央，眼观目镜，调好焦距，使两种测微尺上的刻度平行并重叠在一起。按下面公式计算出目镜测微尺每格的实际长度。

目镜测微尺每格的长度（μm）＝物镜测微尺的格数 / 目镜测微尺的格数×10

计算出目镜测微尺每格的实际长度后，再在镜台上放上需要测量的物体标本或玻片标本，即可用目镜测微尺测出它们的长度。

五、显微结构图的绘制技巧

生物绘图是科学记录的一种方法。绘图时应注意：（1）绘科学图以精确为主，不能艺术加工渲染。（2）只在纸的一面绘图。绘图时要用2H以上绘图铅笔，纸面力求整洁。（3）绘图大小适宜，布局合理。一般要求图画在纸的稍偏左侧，留出图注的位置。（4）图的各部分的位置和比例，应与显微镜中实际观察的一致，而要注意突出显微结构的每个特征。（5）显微构造图的点线不要重复描绘。以实线表示轮廓，虚线表示被遮蔽但需表现的轮廓，用圆点的疏密来表示明暗、凹凸等层次。点点时笔尖直立。点的大小、疏密要均匀、整齐、浑圆。（6）绘图时，一般先草拟轮廓图，经检查无误后，再以准确、清晰的线作最后的描绘。

【解题指导】

例1 用显微镜观察洋葱根尖细胞的有丝分裂，要看清各时期细胞内染色体的变化情况，目镜、物镜的合理搭配应该是

A 目镜（24X）、物镜（10X，N·A0.25）

B 目镜（ 5X）、物镜（40X，N·A0.65）

C 目镜（10X）、物镜（40X，N·A0.65）

D 目镜（24X）、物镜（40X，N·A0.65）

析此题属镜像亮度问题。镜像亮度与物镜镜口率（N·A）平方成正比，与总放大倍数成反比。由此，在总放大倍数相同情况下，要使物像亮度增加，应该使用高镜口率（N·A）的物镜与低倍目镜配合，根据这一原理应选择C。

例2 在观察显微镜时，经常遇到以下5种现象：（1）视野亮度晃眼；（2）视野不圆；（3）对光时视野中出现窗棂、树影等物现象；（4）只见视野不见图像；（5）图像结构不完整，试分析出现这些现象的可能原因，并提出排除方法。

析（1）视野亮度晃眼，可能原因：①反光镜直射强光源；②光照到通光孔上缘。排除方法：①用平面镜斜对光源；②挪镜。（2）视野不圆的可能原因：①遮光器或转换器没有转到头；②遮光器或转换器螺丝动。排除方法：①把两者转到头（弹簧片入槽）；②拧紧螺丝。（3）对光时视野中出现其他物象，其可能原因是镜筒太高或太低，调节一下镜筒即可消除。（4）只见视野不见图像，可能是操作不仔细，低倍镜头偏于一旁。排除方法：将低倍镜头对准通光孔。（5）图像结构不完整的可能原因是未根据材料的不同折光性用光，应调节光圈使透明度一致。

例3 某架显微镜由于磨损，低倍镜上的放大倍数看不清，而高倍物镜尚看得出是40倍，借助实验台上的哪些材料可帮你测出低信镜的放大倍数？说明测定方法。

（实验台上有显微镜、目镜测微尺、物镜测微尺、刻度尺、放大镜）

析此题可利用显微测量技术测定。利用实验台上的显微镜和测微尺进行测量。由于目镜测微尺每格的实际长度因不同物镜的放大倍数有所不同，因此可以在相同目镜下，测量变换高（40X）、低倍物镜下的视野直径，由于放大倍数与视野直径成反比，按下式计算即可求出低倍镜的放大倍数。

高倍镜放大倍数 / 低倍镜放大倍数＝低倍镜视野直径 / 高倍镜视野直径

例4 在一黄粉岬幼虫尾部4～5节的节间刺一针，用毛细吸管取1～4mL血淋巴，再用毛细吸管取15～20mL生理盐水，用血球计数板计细胞数（区别脂类颗粒、组织碎片与细胞），计算血淋巴细胞浓度填入下表。30min重复一次（针刺部位前移一体节），60min重复一次（针刺部位再前移一体节）。

（1）将有关数据填入下表：

时间间隔（min）	血淋巴长度（a）mL	生理盐水（b）mL	细胞数（数25个中方格）	细胞密度（个／mL）
0
30
60

（2）将细胞密度变化绘成曲线，并回答下列问题：

①计数时怎样处理压线细胞？用一句话回答。

②给出计算细胞密度的公式。

③用一句话回答为什么血盖片较一般盖玻片厚。

（注意：针刺幼虫时，食指与中指夹住头部，拇指按住尾部，使其不动。针刺不要过深，不要挑动，以免虫死亡或使头部器官的细胞或杂物进入血淋巴。虫不可死。）

析此题按血球计数极计数的方法操作，所得数据镇入表中。根据绘制函数曲线原理，以时间间隔为横坐标，细胞密度（个／mL）为纵坐标，绘制曲线。在计数时，对压线细胞采取“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则处理。计算细胞数方法：

每mL悬液细胞数＝80个小方格细胞总数 / 80×400×10000×稀释倍数

血盖片比普通盖玻片厚是因为要盖住计数板上的计数室沟槽。

【巩固练习】

1．某同学在做观察洋葱根尖细胞有丝分裂装片时，有两次出了差错。第一次是解离时间为2min，第二次是60min。请你推出实验结果并说明原因。第一次是因，所以观察到的是。第二次，则因，所以。

2．在照明充分的情况下，在显微镜视野内可看清洋葱鳞茎表皮细胞无色的细胞壁，但看不清液泡，为了能显示细胞质与液泡的界面，此时应

A 改用凹面反光镜，放大光圈 B 改用凹面反光镜，缩小光圈

C 改用平面反光镜，放大光圈 D 改用平面反光镜，缩小光圈

3．在显微镜视野中观察玻片标本，物镜测微尺和目镜（5X）测微尺在0点处重合时，物境测微尺的80格与目镜测微尺的55格处也相重叠时，试问目镜测微尺一格的长度是 μm；如观察测量某种植物的细胞大小时，测量其长为7个小格，那么此细胞的实际长度是 μm。

4．撕取所给叶片的下表皮，放在显微镜下观察，绘出保卫细胞及表皮细胞的特征。随机取五个视野计算气孔数，取其平均值，计算气孔密度（个／cm²）。（低倍物镜视野直径为1.5mm，目镜统一用10倍）

第二节物理学和化学分析技术

【知识概要】

－、分离技术

分离技术主要是利用物理学和化学的原理建立起来的各种分离、纯化方法。常用的分离技术有以下几种：

1．纸层析法

层析技术是从一个混合物中分离和纯化一种或几种生物化合物的最简便的方法，用滤纸为支持物的层析法，叫纸层析法。

纸层析用的展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是静止相，纸是静止相的支持物，有机溶剂是流动相，它沿着滤纸流动。若将生物样品（提取液）点在滤纸上（此点称为原点）进行展层，样品中的各种溶质（如叶绿体中的四种色素，各种氨基酸等）即在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同溶质随流动相移动的速率不等，于是就将这些溶质分离开来，形成距原点不等的层析点。

纸层析的具体方法：（1）制样。将样品经研磨、过滤制备成提取液；（2）制备滤纸条。将滤纸剪成长10cm、宽1cm的纸条。在一端用铅笔画一横线（点样线）；（3）点样。用毛细吸管将滤液沿点样线画一直的滤液细线；（4）层析：将层析液（石油醚、丙酮、苯的混合液）倒入烧杯，然后将滤纸条靠烧杯内壁轻轻插入层析液中。（5）结果。几分钟后，出现层析现象。

2．电泳法

电泳技术主要是根据不同物质所带的电荷的数量和性质不同，因而在电场移动中的速度和方向就不同。生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、酶和核酸等都具有可电离的集团，在溶剂中能形成带电荷的分子，由于在不同的溶剂介质中所带的电荷的数量和性质的差别，在电场中泳动的速度（迁移率）不同，由此可以分离各种物质成分。电泳的方法很多，有纸电泳、琼脂平板电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，其中较简单的是纸上电泳法，它是用滤纸作为电泳载体的一种电泳方法。

纸上电泳一般操作过程（以分离血清蛋白为例）：（1）仪器准备。电泳设备主要是电泳仪和电泳槽（见下图）。电泳槽是供两极电泳分离和盛装缓冲液之用。电泳仪提供可控电源。一般采用电压在100～500V，电流在0mA～50mA或100mA。（2）配制缓冲液。缓冲液的种类很多，可用0.5M、pH5.6巴比妥缓冲液或 Ph8.6硼酸缓冲液。缓冲液配好后直接加入两侧电泳槽中。（3）裁剪滤纸。取电泳滤纸，按2×20cm剪裁，于一端约1/3处用铅笔划点样线，将纸用缓冲液浸湿。（4）点样。在点样线上，用50μL微量注射器点样，一般为10mL。点样后，将滤纸放在电泳槽两极隔板上，两端浸入缓冲液中。（5）电泳。接上电源，按滤纸长和宽选用电压（8V／cm）和电流（0.4mA／cm），以点样线一侧为负极，向正极泳行。（6）烘干。取下电泳纸条在烤箱（90℃～105℃）迅速烘干。（7）染色。将烘干滤纸条浸入溴酚兰染液10min，取出以0.5％醋酸溶液脱色，逐渐显出电泳带。（8）比色。将各条区带滤纸剪下，以电泳空白滤纸为对照，在分光光比色计上比色。（9）计算。按光密度值计算出各部分蛋白质的百分数。

水平电泳槽装置

3．离心法

离心法是一种利用物质在溶液中的密度、大小和形状的不同，以及它们沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别，通过强离心力的作用使其分离、浓缩、提纯的技术，并可用于分子量的测定。在生物学研究中，常用离心方法从组织匀浆中分离各种细胞器及各种蛋白质、核酸等生物大分子。

离心的设备主要是离心机，它是利用离心力对混合液进行分离和沉淀的专门仪器。离心机的种类很多，有低速离心机（4000γ/ min以下）、高速离心机（4000γ/ min以上，20000γ/ min以下）和超速高心机（20000γ/ min以上）。

离心分离方法很多，常用的是差速离心机，是指低速和高速离心交替进行，用不同强度的离心力使不同质量的物质分批分离的方法。例如，利用离心机的不同转数（rpm，即γ/ min）和时间，从鼠肝匀浆中分离各种亚细胞组分的过程（下图）：

大白鼠肝脏匀装分级分离各种亚细胞组分图解

二、测定技术

1．定性测定——比色法

生物材料化学成分的测定技术很多，在生物学实验中最常用的简便方法是比色法。

比色法是利用生物组织中的有机物与某些化学试剂相互作用，能产生颜色反应的原理，可以根据颜色反应鉴定生物组织中某种有机物的存在。

从细胞组织中，鉴定有机物的常用比色法，参见下表。

成分	试剂	作用	颜色反应
还原糖	斐林（Fehling）试剂	使自由醛或酮基的糖氧化	产生棕红色Cu₂O沉淀
蛋白质	双缩脲试剂	肽锭在碱性环境中与CuSO₄结合	产生红紫色的络合物
淀粉	碘液	淀粉与碘结合	蓝色反应
脂肪	苏丹Ⅲ酒精溶液	脂肪与苏丹Ⅲ结合	红色反应
维生素A	三氯化锑一氯仿溶液	与SbCl₃作用	蓝色反应
维生素B₁	重氮化氨基苯磺酸溶液	在碱性溶液中发生作用	红色反应
核酸	亚硫酸复红溶液	与DNA发生作用	呈红色或紫色

2．定量测定——滴定法

滴定法是将一定浓度的标准溶液滴入被测物质溶液中，当反应到终点后，根据所用标准溶液的体积计算被测物质的含量，这是一种常用的容量分析法。

滴定法常用的仪器是滴定管。它是带有刻度和活栓的玻璃管，用它放送已知体积的溶液。

滴定法的一般操作技术（以维生素C定量测定为例）：（1）样品制备。将样品（洗净蔬菜）20g，加2％草酸100g，置组织搅拌机中打成浆状。称取5g浆状物倒入50mL容量瓶中以2％草酸溶液稀释至刻度。静置10min，过滤备用。（2）滴定。①标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸（Vc）溶液 1mL（含0.1mgVc）置100mL锥形瓶中，加9Ml1％草酸，微量滴定管以0.1％2，6-二氯酚靛酚滴至淡红色，并保持15sec即为终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少mg抗坏血酸。②样液滴定：准确吸取滤液两份，每份10mL分别放入两个100mL锥形瓶内，测定方法同前。③计算：

V×T / W×100＝100g样品中含抗坏血酸（Vc）mg数

式中：V＝滴定时所用去染料毫升数。T＝1mL染料能氧化Vc毫克数。W＝10mL样液相当于含样品之克数。

【解题指导】

例1 叶绿体中色素的提取和分离：

（1）提取和分离叶绿体的色素，可采用方法。

（2）用毛细吸管在滤纸上划出滤液细线时，线条越细越好，这样可以避免，以便取得较好的。

（3）叶绿体b为黄绿色，层折后的位置是在滤纸条的。

（4）实验应尽量在通风处进行，实验后一定要将手洗净，这是因为。

时间间隔（min）	血淋巴长度（a）mL	生理盐水（b）mL	细胞数（数25个中方格）	细胞密度（个／mL）
0
30
60